摘 要：目前分析儀器微型化的浪潮洶涌澎湃,人們以極大的熱情投入到這個(gè)浪潮中。從世界各地的實(shí)驗(yàn)室里出現(xiàn)的原理型樣機(jī)看上去是如此的微小、簡潔和令人驚詫,有如此多的加工工藝可以應(yīng)用在微型器件的加工和組合上從非常昂貴的、在超凈房間才能使用的精密儀器設(shè)備和工藝到土法上馬、在普通房間就能操作的加工手段。它的前景是那樣的誘人,引無數(shù)英雄一試身手。

關(guān)鍵字：氣相色譜 液相色譜

目前分析儀器微型化的浪潮洶涌澎湃,人們以極大的熱情投入到這個(gè)浪潮中。從世界各地的實(shí)驗(yàn)室里出現(xiàn)的原理型樣機(jī)看上去是如此的微小、簡潔和令人驚詫,有如此多的加工工藝可以應(yīng)用在微型器件的加工和組合上從非常昂貴的、在超凈房間才能使用的精密儀器設(shè)備和工藝到土法上馬、在普通房間就能操作的加工手段。它的前景是那樣的誘人,引無數(shù)英雄一試身手。

從1986 年我第一次聽說微型氣相色譜儀并看到相關(guān)文章,就認(rèn)定它是色譜發(fā)展的未來。1987 年底我在荷蘭第一次看到它時(shí),就下決心今生一定研究微型色譜,因?yàn)樗鼜挠^念上、認(rèn)識(shí)上打開了分析儀器微型化的大門。

真正開始研究微型氣相色譜(μ2GC) 是在1992年的春天,從715 萬元的經(jīng)費(fèi)和國內(nèi)無輔助加工條件的困難境地開始的。至今,科技部、國家自然科學(xué)基金委、中國科學(xué)院、前國家教委、遼寧省科委和本單位對我們研究組在微型色譜儀方面的投入已有300 萬,我們研制的微型氣相色譜儀已經(jīng)在2002 年6 月通過科技部的攻關(guān)課題驗(yàn)收。目前在國家自然科學(xué)基金委儀器研制專項(xiàng)基金的支持下,正在進(jìn)行陣列式微型液相色譜/ 電色譜的研究工作。10 年多的科學(xué)實(shí)踐使我認(rèn)識(shí)到:要進(jìn)行色譜儀器的微型化,首先要對色譜儀器和色譜原理有十分深入的認(rèn)識(shí),不僅從化學(xué)上,更要從基本的物理知識(shí)、統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)、材料學(xué)、力學(xué)、數(shù)學(xué)、機(jī)械和電子器件制造技術(shù)上全面認(rèn)識(shí);要對色譜儀器的每一個(gè)部件和零件的原理、材料、設(shè)計(jì)、尺寸等因素對部件或器件性能的影響有深入的定量的研究,以及它們對整機(jī)性能的定量影響。

在色譜儀器微型化過程中,尺寸的縮小不僅要考慮材料的性質(zhì)和制造上的可能,還要從原理上考慮尺寸縮小后所帶來的一系列問題。這些問題包括:

(1) 分離系統(tǒng)中被分配的分子個(gè)數(shù)是否大于106 ,因?yàn)橹挥写笥?06 才能得到符合統(tǒng)計(jì)結(jié)果的數(shù)據(jù);

(2) 因分離通道尺寸縮小,自然提高了單位柱長的效率,但是總長度的減少可能使總分離效能遠(yuǎn)低于常規(guī)儀器;

(3) 對于質(zhì)量敏感型檢測器,經(jīng)過分離柱后單位時(shí)間內(nèi)到達(dá)檢測器的分子個(gè)數(shù)是否滿足檢測原理所要求的最小數(shù)目;

(4) 對于濃度型檢測器,到達(dá)檢測池的分子數(shù)目是否能滿足符合統(tǒng)計(jì)規(guī)律的分子數(shù)目;

(5) 檢測微區(qū)內(nèi)的外加能量密度是否超過被檢測分子所能承受的極限;

(6) 微量流動(dòng)相的輸送與控制;

(7) 因材料尺寸的縮小,表面層氧化或腐蝕對器件功能的影響。最后,色譜儀器微型化所帶來的好處不僅僅是單位長度分離效率的提高,而是總分離能力的保持甚至提高;不僅僅是分離系統(tǒng)或某個(gè)部件的微型化,而是整體的微型化;不僅僅是質(zhì)量靈敏度的提高,而是濃度靈敏度的保持或提高;不僅僅是能量和物質(zhì)的低消耗,而是使用的方便和友好;不僅僅是整體尺寸的縮小,更重要的是整機(jī)的穩(wěn)定性和可靠性的提高!

下面分別討論上述7 個(gè)問題:

(1) 色譜分離的基本原理是有符合統(tǒng)計(jì)規(guī)律數(shù)目的分子群經(jīng)過不斷的兩相分配和分子碰撞,利用其分配系數(shù)的差異來達(dá)到分離的目的。這是一個(gè)宏觀參數(shù)。當(dāng)分子數(shù)目低于這個(gè)數(shù)目時(shí),就會(huì)偏離統(tǒng)計(jì)規(guī)律而出現(xiàn)所謂的漲落現(xiàn)象。分子數(shù)目越少,漲落現(xiàn)象越嚴(yán)重。當(dāng)分子數(shù)目低于103 個(gè)時(shí),已沒有準(zhǔn)確的色譜保留規(guī)律,因此也就失去了宏觀意義下的分離規(guī)律。一般地,保證符合統(tǒng)計(jì)規(guī)律的分子數(shù)目是106 個(gè)。

例如內(nèi)徑30 μm 的填充毛細(xì)管液相色譜(μ2HPLC) 柱或毛細(xì)管電泳柱,若分別保持10 萬/ m 和40 萬/ m 的分離柱效,直接進(jìn)樣時(shí)不過載的進(jìn)樣量分別為40 pL (1 pL = 10 - 12 L) 和115 pL ,分子總數(shù)分別是112 ×1012～112 ×1014和415 ×1010～415 ×1012 。樣品中含量低至1～0. 01μL/ L (對μ2HPLC) 或低至20～0. 2μL/ L (對CE) 的組分就不能滿足106 個(gè)分子的數(shù)目要求,分離過程中就會(huì)出現(xiàn)上述問題。所以,上述分離系統(tǒng)對濃度高于這個(gè)指標(biāo)的樣品分離時(shí)可以有重復(fù)的保留時(shí)間。如果考慮檢測方面的限制[參見下述的(3) 和(4) > ,痕量分析中用粗內(nèi)徑的填充色譜柱總是優(yōu)于微型色譜柱。

為了能進(jìn)行痕量分析,微型分離分析系統(tǒng)往往采用樣品預(yù)濃縮技術(shù)以補(bǔ)償濃度靈敏度的不足。但為此而發(fā)展的技術(shù)也同樣適用于常規(guī)分離分析系統(tǒng),同樣可以提高常規(guī)儀器的靈敏度,除非樣品量受到嚴(yán)格限制。

(2) 45 年前的色譜柱理論已經(jīng)指出,毛細(xì)管開口柱的內(nèi)徑越小,或填充柱的填料粒度越小,色譜柱的分離效率就越高。毛細(xì)管電泳亦然,只是理論上有些不同,如有散熱問題和塞子流型的特點(diǎn)。微型化中普遍采用的細(xì)內(nèi)徑分離柱并不是微型儀器的專利,所能達(dá)到的高柱效也不是最近才認(rèn)識(shí)到的。如果在現(xiàn)有常規(guī)儀器中使用這種等效內(nèi)徑的色譜柱,再適當(dāng)改進(jìn)進(jìn)樣技術(shù)和檢測器,就會(huì)有與微型色譜或芯片電泳同樣的單位柱長的柱效,同時(shí)還可以有極高的總分離效能,因?yàn)槌Ｒ?guī)儀器中分離柱的長度很少受限,而高的分離效能才是真正有意義的。所以,微型色譜和芯片毛細(xì)管電泳用短分離柱而有快速分離的特點(diǎn),并不是它真正的優(yōu)點(diǎn),因?yàn)橛猛瑯映叽绲姆蛛x柱可以分別在常規(guī)色譜和毛細(xì)管電泳上實(shí)現(xiàn)同樣的效果。用現(xiàn)有的思維模式來進(jìn)行的色譜儀器微型化,導(dǎo)致了使用短分離柱,而且所有的應(yīng)用例子都是用極簡單的樣品,這是因?yàn)檫@樣的微型化儀器的總分離效能太低。

(3) 質(zhì)量型檢測器的響應(yīng)值與單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測器的樣品分子數(shù)成正比。分離柱的樣品容量與柱內(nèi)徑的3 次方(毛細(xì)管開口柱) 或平方(填充柱) 成正比。例如氣相色譜FID 檢測器,用內(nèi)徑50μm 的毛細(xì)管柱只能分析樣品中含量為011 %(1 000 ppm)以上的組分;而用內(nèi)徑530μm 的毛細(xì)管柱能分析樣品中含量為3 ×10 - 7 (013 ppm) 以上濃度的組分,相差3 000倍。雖然細(xì)內(nèi)徑色譜柱的譜帶寬度(表現(xiàn)為色譜峰寬度) 比粗內(nèi)徑色譜柱的窄,能增加單位時(shí)間內(nèi)的分子數(shù)目,但它是與柱徑的平方根(本質(zhì)上是柱效的平方根關(guān)系) 成正比;與柱容量的減少比,仍然虧215 次方。離子化檢測器和熒光檢測器都是質(zhì)量型的,離子化效率一般在10 - 5～10 - 3 ,熒光產(chǎn)率一般在10 - 3 ,所以單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測器的分子數(shù)目必須大于50 ×103～50 ×105 ,具體數(shù)值取決于檢測器的性能。用濃度型檢測器會(huì)極大地改善這種狀況,因?yàn)轫憫?yīng)值主要與目標(biāo)組分的濃度有關(guān)。

特殊的質(zhì)量型檢測器,如具有單分子檢測能力的激光誘導(dǎo)熒光檢測器和熱透鏡檢測器等,已用于CE 和μ2HPLC。但是他們絕對不是微型化的設(shè)備,也不是一臺(tái)色譜儀或電泳儀的價(jià)格所能買到的。

在痕量分析中,用直接進(jìn)樣方式和質(zhì)量型檢測器時(shí),常規(guī)色譜總是優(yōu)于微型色譜。

(4) 從宏觀上講,濃度型檢測器的響應(yīng)值與進(jìn)入檢測池內(nèi)樣品分子的總數(shù)無關(guān),而只與樣品分子和流動(dòng)相分子數(shù)的比值有關(guān)。例如,用50 μm 和530μm內(nèi)徑的毛細(xì)管柱和池體積為012μL的熱導(dǎo)檢測器(μ2TCD) 檢測,最小檢出濃度分別為2 ×10 - 5 (體積分?jǐn)?shù)) 和2 ×10 - 6 (體積分?jǐn)?shù)) ,僅差10 倍。而后者單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測池中的分子數(shù)目比前者多3 ×103倍。所以微型色譜和微型流動(dòng)分析儀器中用濃度型檢測器有利。但是這個(gè)理論是有限度的。如在CE 和μ2HPLC 中,當(dāng)分離柱內(nèi)徑≤75μm、塔板高度≤10μm 時(shí),要求檢測池體積在nL 級(10 - 8～10 - 9L) ,用吸收光譜檢測器(濃度型檢測器) 時(shí),上述理論不再成立。因?yàn)閺奈⒂^看,檢測的原理是利用樣品分子的某種特性,當(dāng)分子數(shù)目不滿足檢測原理所要求的統(tǒng)計(jì)數(shù)目時(shí),表現(xiàn)為噪聲信號。所以在上述的微型分離系統(tǒng)中,最小檢出濃度是很高的,遠(yuǎn)不如常規(guī)分離系統(tǒng)的低。

就檢測器本身而言,微型化會(huì)影響它的響應(yīng)靈敏度。如氣相色譜用的熱導(dǎo)檢測器,由于給定氣體的熱導(dǎo)率與通道的壁間距( d) 有關(guān), 特別是在d ≤015 mm 時(shí),熱導(dǎo)率隨d 的減小而呈幾何增加,因此微型化使熱導(dǎo)檢測器的靈敏度有大幅度提高。所以,微型化研究應(yīng)選擇那些在原理上有利于保持或提高靈敏度的檢測器,或者研究那些有極高檢測靈敏度的檢測器微型化問題,如激光誘導(dǎo)熒光檢測器。

(5) 檢測微區(qū)內(nèi)的外加能量問題。任何檢測原理和技術(shù)都是依賴樣品分子與外加能量的相互作用而產(chǎn)生的物理信號。由于檢測微區(qū)達(dá)到μm 級,而作用到微區(qū)的光或電磁波強(qiáng)度往往比常規(guī)檢測器高幾倍到幾萬倍,以此彌補(bǔ)因樣品分子數(shù)減少而損失的信號2噪聲比值。例如,吸收光譜檢測器或熒光光譜檢測器等常規(guī)檢測器的光斑直徑在500～1 000μm ,而μ2HPLC 或μ2CE 的檢測器光斑直徑僅有30μm ,甚至5μm ,但所用的光源功率往往是相同的,經(jīng)過聚焦,達(dá)到檢測區(qū)的光強(qiáng)度提高了3 個(gè)數(shù)量級甚至更高。在這樣小的微區(qū)內(nèi),如此高的光強(qiáng)度會(huì)產(chǎn)生如下問題:液體汽化、熒光物質(zhì)“漂白”、被檢測分子變性、響應(yīng)非線性等。

(6) 微量流動(dòng)相的輸送與控制。在儀器的微型化中,因?yàn)闅庀嗌V的載氣流量以10 mL/ min到011mL/ min計(jì),液相色譜流動(dòng)相流量以50μL/ min到0105μL/ min計(jì)。特別是液相色譜儀的微流量輸液泵,更是微型化的關(guān)鍵難題。用分流的方法解決用常規(guī)裝置實(shí)現(xiàn)微流量調(diào)控只是權(quán)宜之計(jì);同樣,通過改裝常規(guī)檢測器來適應(yīng)微型儀器也是很牽強(qiáng)的。例如,由于動(dòng)態(tài)密封的微滲漏,現(xiàn)有的機(jī)械/ 電子式氣體流量控制閥幾乎不能對1 mL/ min的流量有1 %的控制精度;現(xiàn)有的液相高壓輸液系統(tǒng)也不能對015μL/ min的流量有3 %的控制精度。而上述精度都是微型色譜儀所需要的。所以,只有從原理上、材料上、技術(shù)工藝上和工程上都重新研究和設(shè)計(jì),才能有真正意義上的微型化。

(7) 因所用材料質(zhì)量的微小,表面層氧化或腐蝕對器件功能的影響遠(yuǎn)大于常規(guī)色譜儀器。例如熱導(dǎo)檢測器(TCD) 中的敏感熱絲,常規(guī)的直徑在100μm ,而微型化的熱敏層厚度僅有幾個(gè)μm 甚至1μm ,所以必須解決熱敏層老化或腐蝕的難題。再比如微型化的電化學(xué)檢測器,電極厚度在10 - 1μm 量級,而常規(guī)的在102μm 量級,兩者相差幾百倍。所以,微型化的器件必須解決耐腐蝕和老化問題,才能成為實(shí)用化的器件,而不僅僅是展品或樣機(jī)。

此外,對于二維分離系統(tǒng),分離效率決不是簡單的第1 根柱效( N1) ×第2 根柱效( N2) ,而是與柱的選擇性有直接關(guān)系。當(dāng)某一對組分在其中一維上不能達(dá)到徹底分離時(shí),往往在另一維上的分離度也為零。所以真正有意義的二維分離系統(tǒng)必須是:同系列化合物的目標(biāo)組分對必須在某一維上達(dá)到徹底分離,而不同維擔(dān)當(dāng)分離不同族化合物的任務(wù)。

在設(shè)計(jì)構(gòu)思上,微型化不僅是簡單尺寸的縮小,其本質(zhì)上的進(jìn)步是在解決原理性難題的過程中不斷的創(chuàng)新。

不論從科學(xué)上還是實(shí)用上,片面追求分離系統(tǒng)的微小化而忽視檢測靈敏度和檢測濃度范圍的問題;追求單位柱長分離效率的提高和快速檢測而忽視實(shí)際樣品分離對總柱效的要求;追求進(jìn)樣區(qū)和分離柱的微小化而忽視其可操作性和檢測設(shè)備的微型化,是目前微型化研究的誤區(qū)。從戰(zhàn)略上講,整體微型化的難點(diǎn)問題是分析化學(xué)微型化發(fā)展的基本難題,雖然有時(shí)解決這些問題不是分析化學(xué)學(xué)科領(lǐng)域的事,但是因?yàn)槠渌麑W(xué)科沒有遇到這類問題,致使這些問題成為游離于所有學(xué)科的、但是又需要多學(xué)科交叉才能解決的科學(xué)和技術(shù)難題。所以,微型化不是簡單的分析化學(xué)問題,而是分析化學(xué)與材料學(xué)、流體力學(xué)、電磁學(xué)、微加工技術(shù)和工藝、電子學(xué)、生化和有機(jī)化學(xué)等學(xué)科的交叉,是能夠在本質(zhì)上推動(dòng)分析化學(xué)發(fā)展的年輕的學(xué)科。

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