摘要: 介紹二惡英化合物檢測方法。針對應(yīng)用檢測中存在的難點(diǎn)和問題，對各種檢測方法進(jìn)行分析比較：化學(xué)儀器檢測靈敏度高、選擇性好、特異性強(qiáng)，但樣品前處理過程比較復(fù)雜，對實(shí)驗條件的專業(yè)化程度要求高；生物檢測方法前處理過程簡化，樣品檢測時間短、檢測成本低，對實(shí)驗條件的專業(yè)化程度要求不高，但檢測靈敏度和精確度相對稍差，適用于大批量二惡英樣品的快速定量篩選。提出在我國建立二惡英化合物分級檢測體系，以應(yīng)對二惡英對我國人群健康和環(huán)境安全的威脅。

 

關(guān)鍵詞:  二惡英  檢測方法  分析比較  檢測體系 

 

 

1  前言

 

 

二惡英化合物（簡稱二惡英）是劇毒有機(jī)污染物。人體長期低劑量接觸，會導(dǎo)致癌癥、雌性化、胎兒畸形、糖尿病等疾病。自比利時發(fā)生二惡英食品污染事件和《POPs公約》在瑞典斯德哥爾摩簽署以來，二惡英檢測與污染防治在國際上受到越來越廣泛的關(guān)注[1]。二惡英檢測屬超痕量、多組分檢測，對特異性、選擇性和靈敏度要求極高，被認(rèn)為是當(dāng)代化學(xué)分析領(lǐng)域的一大難點(diǎn)。美國較早開展二惡英檢測研究，現(xiàn)已制定出一系列的檢測標(biāo)準(zhǔn)。歐洲和日本也相繼研究和制定了二惡英檢測標(biāo)準(zhǔn)方法。我國目前正處于二惡英基礎(chǔ)研究的起步階段，尚未提出相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)和方法，因此亟待建立符合我國國情的二惡英檢測方法和體系。

 

 

2  二惡英檢測方法

 

2.1化學(xué)儀器分析方法

 

在200余種異構(gòu)體中分離出17種有明顯毒性的二惡英 ，分別測定其濃度或含量。將濃度或含量乘以每種二惡英的毒性因子（TEF）就可以得到總毒性當(dāng)量（TEQ）。該方法的一般程序包括采樣、提取、凈化、定性定量。

 

2.1.1    采樣 

 

樣品的取樣量由樣品類型、污染水平和方法的檢測限而定。各國對采樣程序都單獨(dú)編制了標(biāo)準(zhǔn)方法。2.1.2  提取 

 

為了測定提取凈化效率和校正分析丟失，首先加入17種13C－PCDD/Fs采樣內(nèi)標(biāo)和37Cl－2,3,7,8－TCDD凈化內(nèi)標(biāo)。溶劑選擇和提取步驟取決于樣品類型和凈化方法，如在處理廢棄物焚燒飛灰時溶劑選取石油醚/甲苯/二氯甲苯，在處理脂肪樣品時溶劑選取二氯甲烷/己烷。提取步驟一般包括溶解、振蕩、混勻和萃取。索氏萃取是傳統(tǒng)的提取方法，廣泛應(yīng)用于檢測飛灰、魚、牛乳和脂肪組織樣品中的二惡英。目前，超臨界流體萃取裝置（SFE）、加壓加熱型的高速溶劑萃取裝置（ASE）和微波萃取方法也用于提取樣品中的二惡英，并有大量對比實(shí)驗證明了這些方法的有效性[3,4]。

 

2.1.3  凈化 

 

為了除去大量干擾物質(zhì)，目前大多采用色譜法進(jìn)行凈化。色譜法通常將分配處理柱和色譜柱串聯(lián)使用，包括酸或堿處理、硅膠柱、氧化鋁柱、佛羅里柱和活性炭柱的二次凈化，具體操作因樣品類型和基質(zhì)性質(zhì)而異。目前，一些實(shí)驗室正在開發(fā)一次性多層柱（如微型氧化鋁柱）和HPLC凈化方法來簡化凈化過程。凈化后要加入15種13C－PCDD/Fs定量內(nèi)標(biāo)和2個13C標(biāo)記的用于確定色譜保留時間的內(nèi)標(biāo)[5]。

 

2.1.4  定性定量  

 

通常定性檢測采用2類不同極性的色譜柱。首先用非極性或弱極性固定相將氯原子取代數(shù)相同的二惡英化合物分為1組，然后用極性固定相分離其中的異構(gòu)體，最后通過對17 種標(biāo)記的和未標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)樣品實(shí)施比較，獲取保留時間。定量檢測主要采用選擇離子監(jiān)測技術(shù)（SIM），以13C穩(wěn)定同位素為內(nèi)標(biāo)，根據(jù)測量目的用質(zhì)量校正程序校正質(zhì)譜模式、分辨率（M/?M=10,000以上，10％谷峰）等，并儲存質(zhì)量校正結(jié)果。對氯不同取代程度的異構(gòu)體分別定量。儀器可選擇高分辨質(zhì)譜儀（HRMS）、四級桿低分辨質(zhì)譜儀（LRMS）。

 

2.2  生物學(xué)檢測方法

 

 目前建立的生物學(xué)檢測方法均是通過對Ah受體活化程度的測定來間接表達(dá)二惡英的TEQ。

 

2.2.1  EROD細(xì)胞培養(yǎng)法 

 

 二惡英與Ah受體結(jié)合活化后，被Ah受體核轉(zhuǎn)位因子（ARNT）轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，活化的核內(nèi)基因是特異性DNA片段即二惡英響應(yīng)因子（DRE）。啟動發(fā)揮毒性的基因并增加其轉(zhuǎn)錄，從而激活EROD酶的活性。所以通過測定EROD酶的活性，可以了解二惡英激活Ah受體的能力，進(jìn)而獲得測試樣品中二惡英的TEQ[6]。

 

2.2.2  螢光素酶方法   

 

該方法是將螢火蟲螢光素酶作為報告基因結(jié)合到控制轉(zhuǎn)錄的DRE上，制備成質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)染H4IIE大白鼠肝癌細(xì)胞系（含Ah受體傳導(dǎo)途徑的各個部件）。以此構(gòu)成的CALUX系統(tǒng)螢光素酶誘導(dǎo)活性與二惡英 的毒性系數(shù)相對應(yīng)，最終測定的結(jié)果也是TEQ[6]。

 

2.2.3   EIA酶免疫方法 

 

該方法是根據(jù)鼠單克隆抗體DD3與二惡英結(jié)合的特點(diǎn)而建立的競爭抑制酶免疫方法。使用酶競爭配合物（HRP）和樣品中二惡英共同競爭有限的DD3抗體的特異性結(jié)合位點(diǎn),以一系列不同濃度的2,3,7,8－TCDD為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，作出2,3,7,8-TCDD標(biāo)樣與對應(yīng)樣品的劑量－效應(yīng)曲線，樣品中二惡英毒性強(qiáng)度以計算出的TCDD毒性等價濃度間接表示。最終通過測定DD3與HRP螯合物的熒光強(qiáng)度來獲取二惡英的TEQ。螯合物的熒光強(qiáng)度與二惡英的TEQ成反比[7]。

 

2.2.4  DELFIA熒光免疫法 

 

DELFIA（Dissociation-enhancement Lanthanide Fluoro Immunoassay）法屬于時間分辨熒光免疫分析法。該方法利用生物基因技術(shù)選擇出合適的抗原鍵合銪離子與樣品中二惡英競爭單克隆抗體，待免疫反應(yīng)完全后加入熒光增強(qiáng)液,使銪離子從抗原中解離下來，進(jìn)入增強(qiáng)液,形成膠束，高效地發(fā)出熒光。螯合物最終用時間分辨熒光法分析，其熒光強(qiáng)度與二惡英的TEQ成反比[8]。

 

 

3  二惡英檢測方法分析比較

 

3.1 化學(xué)儀器檢測

 

目前，HRGC/HRMS法是被認(rèn)可的二惡英標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，如美國的EPA 1613方法和日本工業(yè)用的JIS K0311方法。它們具有檢測靈敏度高和能同時檢測多個離子等優(yōu)點(diǎn)，但所要求的樣品前處理過程非常復(fù)雜，導(dǎo)致檢測成本上升，一般檢測1個樣品需要900～1800美元。檢測工作只能在少數(shù)專業(yè)化程度較高的實(shí)驗室中進(jìn)行，而建造二惡英專業(yè)檢測實(shí)驗室一般需要投資數(shù)百萬美元以上。所有這些不利因素都制約著對二惡英開展大規(guī)模、大范圍的低成本檢測與研究。

 

在實(shí)際檢測過程中，使用GC/HRMS法可保證靈敏度，簡化前處理步驟，縮短檢測時間，降低檢測成本，但仍需在專業(yè)實(shí)驗室中完成；使用HRGC/LRMS法可極大降低在檢測儀器方面的投入，但當(dāng)每克樣品中二惡英濃度低于pg/g水平時，卻無法獲得可靠的檢測結(jié)果。因而HRGC/LRMS法僅適用于檢測二惡英濃度較高的污染源樣品和污染較重的土壤樣品。例如，美國的EPA 8280方法可檢測出土壤、底泥、飛灰和燃油等樣品中含4～8個氯的二惡英化合物，不能用于檢測如食品等二惡英含量較低的樣品。

 

3.2  生物學(xué)檢測

 

目前生物學(xué)檢測方法主要用于對二惡英樣品的定量篩選。研究表明，EROD法具有較好的準(zhǔn)確性和較寬的線性范圍，但測得的樣品TEQ略高于使用標(biāo)準(zhǔn)方法獲得的結(jié)果 。螢光素酶方法在牛乳樣品二惡英檢測實(shí)驗中，與標(biāo)準(zhǔn)方法相比在檢測結(jié)果方面比較一致，說明該方法可用于食品樣品的二惡英毒性檢測。上述都屬于細(xì)胞培養(yǎng)法，檢測時需要配制各種濃度的細(xì)胞試液，一般化學(xué)實(shí)驗室不具備這樣的條件。而且培養(yǎng)時間長達(dá)24h，整個檢測過程需要數(shù)日，不能滿足快速檢測的要求[1]。此外，EIA酶免疫方法與標(biāo)準(zhǔn)方法相比，測得的TEQ值也比較一致，但靈敏度比較低。

 

 

 

DELFIA法是一種最新的二惡英檢測方法,由于不需要細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)活化過程，體外活化時間僅需2h，因此1個批次樣品檢測可在8h內(nèi)完成，極大地提高了檢測效率。使用銪標(biāo)記抗原,采用時間分辨熒光技術(shù),可以消除非特異性熒光的干擾，使免疫方法的靈敏度大大提高。由于靈敏度的提高，檢測所需試樣量少，因此降低了檢測成本。一般1個樣品的平均檢測成本僅10～15美元。同時，該方法對實(shí)驗條件要求不高，大部分檢測工作均可在常規(guī)實(shí)驗室甚至現(xiàn)場完成，無需建造專業(yè)實(shí)驗室的高成本投入，適于對大批量樣品實(shí)施快速定量篩選。

 

表1 二惡英檢測方法對比分析

檢測方法 前處理過程 檢測時間 檢測成本 靈敏度 實(shí)驗條件成本 （d） （美元/單位樣品） （pg/g） (×1000美元) HRGC/HRMS法 復(fù)雜 14 900～1800 0.01 800 GC/HRMS法 有些簡化 3～7 500～1000 0.1 700 GC/LRMS法 有些簡化 3 400～500 1 200 EROD法 比較簡化 3 1000～1200 1 200 螢光素酶法 比較簡化 3 200～900 0.025 200 EIA法 比較簡化 2 200～900 0.5 200 DELFIA法 十分簡化 < 24h 10～15 0.1 3~5

 

 

 

 

4  結(jié)論與建議

 

以HRGC/HRMS法為代表的化學(xué)儀器分析方法具有檢測靈敏度高、選擇性好、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但其樣品前處理過程比較復(fù)雜，對實(shí)驗條件的專業(yè)化程度要求高，檢測時間長，檢測成本高，因而具有一定的應(yīng)用局限性，主要用于樣品規(guī)模較小、精度要求較高的專門檢測。與其相比，生物檢測方法的前處理過程比較簡化，樣品檢測時間短、檢測成本低，對實(shí)驗條件的專業(yè)化程度要求不高，但是其檢測靈敏度和精確度相對稍差，比較適用于大批量二惡英樣品的快速定量篩選。

 

目前，我國的食品和環(huán)境安全正日益受到二惡英污染的威脅。因此應(yīng)結(jié)合實(shí)際需要，在滿足降低成本、提高效率的前提下，綜合利用各種檢測方法的優(yōu)勢，盡快建立起能夠滿足定量篩選、常規(guī)檢測和認(rèn)證分析等不同要求、符合我國國情的多層次分級二惡英檢測體系。在該體系內(nèi)，低成本、快速的生物檢測方法可應(yīng)用于一般食品檢測和環(huán)境監(jiān)測，如定量篩選大規(guī)模的污染源樣品等。而一般的化學(xué)儀器分析包括GC/HRMS法和HRGC/LRMS法，可應(yīng)用于對篩選出的樣品進(jìn)行較高精度的檢測。最后，可以通過建立幾個符合國際標(biāo)準(zhǔn)的二惡英專業(yè)檢測實(shí)驗室，完成對二惡英檢測的權(quán)威認(rèn)證分析工作，這對推動我國的二惡英基礎(chǔ)研究和污染防治工作將起到積極的作用。

 

 

 

5  參考文獻(xiàn)

 

1吳永寧,王緒卿. 二惡英極其類似物對環(huán)境與食品污染. 中國食品衛(wèi)生雜志,1999,11(5): 27～33.

 

2 田洪海,全浩. 固體廢棄物焚燒處理中二惡英的排放.環(huán)境科學(xué)研究,1998,11(3): 5～7.

 

3 Malisch R, Metschies M. Development of analytical methods for determination of dioxins. Advantages of tritium labeled TCDD and carbon 14-labeled OCDD. Chemosphere, 1994, 29 (9): 1819～1827.

 

4 Eljarrant E, caixach J, Rivera J. Microwave vs soxhler for the extraction of PCDD and PCDF from sewage samples. Chemosphere, 1998, 36(10):2359～2366.

 

5 WuWZ,SchrammK.-W,Henkelmann B，et al.PCDD/Fs,PCBs, HCHs and HCB in sediments and soil of Ya-er lake area in China: Results on residual levels and correlation to the organic carbon and the particle size. Chemo-sphere., 1997, 34(1):191～202.

 

6袁倬斌，李珺.二惡英類分析研究進(jìn)展及展望.分析化學(xué)評述進(jìn)展.2001, 29(10):1222～1227. 

 

7 黎雯,徐盈,吳文忠，等. 利用EIA生物測試法快速定量篩選環(huán)境樣品中的二惡英污染物.環(huán)境科學(xué),2000,21(4):69～72. 

 

 

8 常文保,王敏燦,張柏林，等. 稀土螯合物探針及其在時間分辨熒光免疫分析中的應(yīng)用.大學(xué)化學(xué),1997,12(1):1～6.

 

 

 

 

4  結(jié)論與建議

 

以HRGC/HRMS法為代表的化學(xué)儀器分析方法具有檢測靈敏度高、選擇性好、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但其樣品前處理過程比較復(fù)雜，對實(shí)驗條件的專業(yè)化程度要求高，檢測時間長，檢測成本高，因而具有一定的應(yīng)用局限性，主要用于樣品規(guī)模較小、精度要求較高的專門檢測。與其相比，生物檢測方法的前處理過程比較簡化，樣品檢測時間短、檢測成本低，對實(shí)驗條件的專業(yè)化程度要求不高，但是其檢測靈敏度和精確度相對稍差，比較適用于大批量二惡英樣品的快速定量篩選。

 

目前，我國的食品和環(huán)境安全正日益受到二惡英污染的威脅。因此應(yīng)結(jié)合實(shí)際需要，在滿足降低成本、提高效率的前提下，綜合利用各種檢測方法的優(yōu)勢，盡快建立起能夠滿足定量篩選、常規(guī)檢測和認(rèn)證分析等不同要求、符合我國國情的多層次分級二惡英檢測體系。在該體系內(nèi)，低成本、快速的生物檢測方法可應(yīng)用于一般食品檢測和環(huán)境監(jiān)測，如定量篩選大規(guī)模的污染源樣品等。而一般的化學(xué)儀器分析包括GC/HRMS法和HRGC/LRMS法，可應(yīng)用于對篩選出的樣品進(jìn)行較高精度的檢測。最后，可以通過建立幾個符合國際標(biāo)準(zhǔn)的二惡英專業(yè)檢測實(shí)驗室，完成對二惡英檢測的權(quán)威認(rèn)證分析工作，這對推動我國的二惡英基礎(chǔ)研究和污染防治工作將起到積極的作用。

 

 

 

5  參考文獻(xiàn)

 

1吳永寧,王緒卿. 二惡英極其類似物對環(huán)境與食品污染. 中國食品衛(wèi)生雜志,1999,11(5): 27～33.

 

2 田洪海,全浩. 固體廢棄物焚燒處理中二惡英的排放.環(huán)境科學(xué)研究,1998,11(3): 5～7.

 

3 Malisch R, Metschies M. Development of analytical methods for determination of dioxins. Advantages of tritium labeled TCDD and carbon 14-labeled OCDD. Chemosphere, 1994, 29 (9): 1819～1827.

 

4 Eljarrant E, caixach J, Rivera J. Microwave vs soxhler for the extraction of PCDD and PCDF from sewage samples. Chemosphere, 1998, 36(10):2359～2366.

 

5 WuWZ,SchrammK.-W,Henkelmann B，et al.PCDD/Fs,PCBs, HCHs and HCB in sediments and soil of Ya-er lake area in China: Results on residual levels and correlation to the organic carbon and the particle size. Chemo-sphere., 1997, 34(1):191～202.

 

6袁倬斌，李珺.二惡英類分析研究進(jìn)展及展望.分析化學(xué)評述進(jìn)展.2001, 29(10):1222～1227. 

 

7 黎雯,徐盈,吳文忠，等. 利用EIA生物測試法快速定量篩選環(huán)境樣品中的二惡英污染物.環(huán)境科學(xué),2000,21(4):69～72. 

 

 

8 常文保,王敏燦,張柏林，等. 稀土螯合物探針及其在時間分辨熒光免疫分析中的應(yīng)用.大學(xué)化學(xué),1997,12(1):1～6.